RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus

Tema: Ensayo de RT-PCR en tiempo real para genotipado de rotavirus

Objetivo: Evaluar la eficacia de la PCR en tiempo real como una herramienta de diagnóstico para la detección y genotipado de cepas de rotavirus en muestra de heces de pacientes con gastroenteritis aguda.

Muestra biológica: Heces  (niños de 5 años o menos con un diagnóstico primario de gastroenteritis aguda no sanguinolenta) 

Tipo de ácido nucleico: ARN de rotavirus

Extracción de ácido nucleico:  Las muestras de heces primero  fueron almacenadas a -70°C después del análisis primario y se preparó una suspensión  de peso por volumen (p/v). Se disolvió un gramo o 100 µl de cada muestra de heces en 1000  µl de Buffer Salino Fosfato (PBS), la muestra se centrifugó a 1500 xg durante 20 minutos. Se extrajo el ARN de rotavirus  de 10µl  del sobrenadante filtrado mediante el método  estándar con fenol-cloroformo.  Luego se realizo la transcripción inversa para poder sintetizar el ADN complementario utilizando el kit de transcripción  inversa RevertAid RT.

Gen o secuencia a amplificar:  Del gen VP7 se amplifico los genotipos  (G1, G2, G9)  y del gen  VP4 se  amplifico los genotipos (P4 y P8).

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Tipo de PCR:  PCR en tiempo real TaqMan y PCR multiplex semianidada

Pasos: 

      1.    Pre-ciclo: 95°C durante 5 minutos

      2.    40 ciclos de amplificación: 

             a) Desnaturalización: 94°C durante 1 minuto

             b) Alineación: 55°C durante 1 minuto

             c)Extensión: 72 °C durante 1 minuto

     3.     Elongación final: 72°C durante 10 minutos

Visualización: Fueron analizados en gel de agarosa al 2% y visualizados utilizando GelRed (tinte ocupado para tinción de ácidos nucleicos) permite determinar  presencia, tamaño y cantidad de los fragmentos amplificados. Los fragmentos de ADN amplificados se separan  por tamaño en el gel de agarosa mediante electroforesis.

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Referencias Bibliográficas: 

1. Mousavi-Nasab SD, Sabahi F, Kaghazian H, Paryan M, Mirab Samiee S, Ghaderi M, et al.   Un ensayo de RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus. Irán Biomed J [Internet]. 2020 [citado el 14 de junio de 2024];24(6):394–9. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/