Animal transgénico para uso de la medicina

ACTIVIDAD 1 

Tema: Diseño y prueba de un donante porcino humanizado para xenotrasplantes

1) Tipo de animal transgénico y genes involucrados

•  Raza de cerdo miniatura de Yucatán (Donante porcino humanizado)
• Genes involucrados:  

GGTA1: este gen codifica una glicosiltransferasa que produce el epítopo galactosilα1,3-galactosa (Gal)

CMAH: Este gen está relacionado con la síntesis de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc)

B4GALNT2/B4GALNT2L:  involucrados en la síntesis de ciertos glicanos.

Además se introdujo transgenes humanos como: CD46, CD55, THBD, PROCR, CD47, TNFAIP3 y HMOX1

Todos estos genes son muy importantes para la aceptación del injerto y reducir el rechazo por parte de los anticuerpos.

2) Métodos de obtención

• Diseño de ARN guía: Para dirigir el sistema CRISPR/Cas9 a los genes objetivo para la eliminación o inserción.

• Edición Genética: Se utiliza CRISPR/Cas9 para realizar las modificaciones deseadas en el genoma del cerdo. Permitiendo la eliminación de genes (knock-out) y la inserción de transgenes humanos (knock-in).

• Transferencia Nuclear de Células Somáticas (SCNT): Se realiza la transferencia del núcleo de una célula somática modificada a un óvulo enucleado (se le ha removido el núcleo) para formar un embrión.

• Implantación y Desarrollo: El embrión se implanta en una cerda de alquiler, donde se desarrolla hasta el nacimiento.

• Selección y Análisis: Los cerdos nacidos se analizan genéticamente para confirmar que llevan las modificaciones deseadas. Se realizan pruebas adicionales para verificar la expresión de los transgenes y la funcionalidad de las modificaciones.

3) Utilización de los animales transgénicos 

• Raza de cerdo miniatura de Yucatán: Utilizado para realizar  un trasplante de riñón porcino modificado genéticamente a un mono cynomolgus. Con estos estudios poder a futuro ponerlos a prueba en humano y  pueda ser genéticamente compatible, tenga un riesgo mínimo de rechazo y proporcione una buen funcionalidad. (1)

Imagen obtenida de : https://www.nature.com/articles/s41586-023-06594-4

ACTIVIDAD 2

5 ventajas y 5 desventajas de los transgénicos

VENTAJAS

• Por medio microorganismos transgénicos (bacterias)  permiten utilizarlos para producir  medicamentos a gran escala y de manera mas eficiente y rápida.

• Mediante los animales transgénicos permiten ampliar en el campo de la investigación para estudiar enfermedades humanas y desarrollar tratamientos (2)

• Por medio de la ingeniería genética se ha ocupado en los animales transgénicos para producir proteínas terapéuticas permitiendo el desarrollo innovador ante enfermedades. (3)

• Han generado un gran avance en el desarrollo de terapias génicas para corregir  defectos genéticos a nivel celular, permitiendo corregir mutaciones de enfermedades raras.  (4)

• Las plantas modificadas genéticamente permiten producir antígenos virales para facilitar la producción de vacunas de forma rápida. (5)

DESVENTAJAS

• Los medicamentos que se realizaron por medio de organismo transgénicos pueden generar efectos adversos debido a que contengan contaminantes o proteínas no deseadas (2)

• El uso de animales para las investigaciones de enfermedades se ve muy relacionado con el bienestar animal. Ya que ellos también son seres vivos , sienten y pueden estar expuestos al sufrimiento. (5)

• Puede existir contaminación genética debido que existe la posibilidad de que los genes modificados se transfieran a otras especies o al medio ambiente, provocando consecuencias que no se puedan predecir.

• El uso de transgénicos para el desarrollo de terapias puede ser muy costoso y ser un proceso complejo y a la vez largo. Es por esto que limita la accesibilidad para personas que no posean una gran entrada económica a su hogares. 

• Puede haber problemas de acceso y equidad  en el suministro de medicamentos o vacunas  debido a las patentes de estos productos. (4)

Referencias Bibliográficas:

1. Anand R, Layer J, Heja D, Hirose T, Lassiter G, Firl D. Diseño y prueba de un donante porcino humanizado para xenotrasplante. Nature [Internet]. 2023 [citado el 27 de julio de 2024];622(7982):393–401. Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41586-023-06594-4
2. Simmons D. El uso de modelos animales en el estudio de enfermedades genéticas. Scitable by Nature Education [Internet]. 2008 [citado el 27 de julio de 2024]. Disponible en: https://www.nature.com/scitable/topicpage/the-use-of-animal-models-in-studying-855/

3. Seok Y. Avances recientes en la terapia con anticuerpos. Int J Mol Sci [Internet]. 2022 [citado el 27 de julio de 2024];23(7):3690. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3390/ijms23073690

4. Sharaf  W. Tecnologías de edición genética y ensayos clínicos relacionados para el tratamiento de enfermedades genéticas y adquiridas: una revisión sistemática. Egypt J Med Hum Genet [Internet]. 2024[citado el 27 de julio de 2024];25(1). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1186/s43042-024-00501-w

5. Salazar-González JA, Rosales-Mendoza S. Una perspectiva para la vacunación contra la aterosclerosis: ¿hay lugar para las vacunas de origen vegetal? Vaccine [Internet]. 2013;31(10):1364–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.01.005

6. Perry P. La ética de la investigación con animales: una perspectiva del Reino Unido. ILAR J [Internet]. 2007 [citado el 17 de julio de 2024];48(1):42–6. Disponible en: https://academic.oup.com/ilarjournal/article/48/1/42/690435?login=false

ADN recombinante artificial y natural

ACTIVIDAD 20 

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

Tema: Producción de proteínas candidatas como dianas terapéuticas contra la malaria

Objetivos:  

• Extracción del gen cyrpa de muestras sanguíneas de pacientes del sur de México.
• Secuenciación del gen cyrpa y análisis de polimorfismos.
• Clonación del gen cyrpa en un plásmido para su utilización en la transformación de células procariotas.
• Expresión de la proteína CyRPA en células procariotas.

Gen o secuencia a clonar: Gen cyrpa

Enzima de restricción: BamHI y Ndel

Enzima ligasa: Ligasa de ADN T4

Vector: pET-9a(+)

Célula receptora: Procariota - Escherichia coli cepa BL21 (DE3)

Mecanismo de transferencia: Transformación por Shock Térmico

Métodos de identificación de clones: 

• Por medio de cultivo líquido en medio Luria-Bertani (contabilizo número de colonias)
• PCR,  Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, Técnicas fluorométricas (SYBR Green). 
• Gen resultante cyrpa
• Proteína obtenida CyRPA
• Se plantea el uso de vectores virales recombinantes como estrategias prometedoras en la lucha contra la malaria (1)

Imagen obtenida de: https://repositorio.ual.es/handle/10835/10260

ADN RECOMBINANTE NATURAL

Transposones o genes saltarines  

Son secuencias de ADN que tienen la capacidad de poder cambiarse de posición en el genoma. Por tanto son capaces de generar diversas formas de expresión de genes o a su vez mutaciones.(2)

Imagen obtenida de: https://ciencia.estudiareneuropa.eu/s/3975/76710-Medicina-Sanidad/4085608-Los-transposones-y-el-desarrollo.htm

Referencias Bibliográficas

1. Cebrián J. Producción de proteínas candidatas a dianas terapéuticas frente a la malaria. Universidad de Almería [Internet]. 2020 [citado el 17 de julio de 2024]. Disponible en: https://repositorio.ual.es/handle/10835/10260

2. Kumar A. Saltar: transposones dentro y fuera del laboratorio. F1000Res [Internet]. 2020 [citado el 18 de julio de 2024];9(135):135. Disponible en: https://f1000research.com/articles/9-135/pdf

   
   

Hibridación fluorescente in situ en carcinoma uroterial

La hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizó para detectar alteraciones cromosómicas en células uroteliales. En especifico las aneuploidías en los cromosomas (cr) 3,7,17 y para la pérdida del locus 9p21.  Se utilizo sondas específicas marcadas con fluorocromos  (secuencias de ADN complementario) y se hibridaron con muestras de células uroteliales fijadas y mediante la emisión de señales fluorescentes se puedo observar y analizar las muestras por medio  del microscopio de fluorescencia. 

Disponible en: 

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0210480612003889?via%3Dihub

Referencias bibliográficas 

1. García-Peláez B, Trias I, Román R, Pubill C, Banús JM, Puig X. La hibridación in situ fluorescente en la predicción de recurrencia del carcinoma urotelial. Actas Urol Esp [Internet]. 2013 [citado el 22 de junio del 2024];37(7):395–400. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.acuro.2012.11.005. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0210480612003889?via%3Dihub

RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus

Tema: Ensayo de RT-PCR en tiempo real para genotipado de rotavirus

Objetivo: Evaluar la eficacia de la PCR en tiempo real como una herramienta de diagnóstico para la detección y genotipado de cepas de rotavirus en muestra de heces de pacientes con gastroenteritis aguda.

Muestra biológica: Heces  (niños de 5 años o menos con un diagnóstico primario de gastroenteritis aguda no sanguinolenta) 

Tipo de ácido nucleico: ARN de rotavirus

Extracción de ácido nucleico:  Las muestras de heces primero  fueron almacenadas a -70°C después del análisis primario y se preparó una suspensión  de peso por volumen (p/v). Se disolvió un gramo o 100 µl de cada muestra de heces en 1000  µl de Buffer Salino Fosfato (PBS), la muestra se centrifugó a 1500 xg durante 20 minutos. Se extrajo el ARN de rotavirus  de 10µl  del sobrenadante filtrado mediante el método  estándar con fenol-cloroformo.  Luego se realizo la transcripción inversa para poder sintetizar el ADN complementario utilizando el kit de transcripción  inversa RevertAid RT.

Gen o secuencia a amplificar:  Del gen VP7 se amplifico los genotipos  (G1, G2, G9)  y del gen  VP4 se  amplifico los genotipos (P4 y P8).

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Tipo de PCR:  PCR en tiempo real TaqMan y PCR multiplex semianidada

Pasos: 

      1.    Pre-ciclo: 95°C durante 5 minutos

      2.    40 ciclos de amplificación: 

             a) Desnaturalización: 94°C durante 1 minuto

             b) Alineación: 55°C durante 1 minuto

             c)Extensión: 72 °C durante 1 minuto

     3.     Elongación final: 72°C durante 10 minutos

Visualización: Fueron analizados en gel de agarosa al 2% y visualizados utilizando GelRed (tinte ocupado para tinción de ácidos nucleicos) permite determinar  presencia, tamaño y cantidad de los fragmentos amplificados. Los fragmentos de ADN amplificados se separan  por tamaño en el gel de agarosa mediante electroforesis.

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Referencias Bibliográficas: 

1. Mousavi-Nasab SD, Sabahi F, Kaghazian H, Paryan M, Mirab Samiee S, Ghaderi M, et al.   Un ensayo de RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus. Irán Biomed J [Internet]. 2020 [citado el 14 de junio de 2024];24(6):394–9. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Alteraciones de la epigénetica en la obesidad

La deficiencia de SETD2 ocasiona la disminución H3K36me3 metiltransferasa que puede sufrir una modificación epigénetica y por tanto contribuir al silenciamiento de genes, afectando la regulación de la homeostasis del colesterol y evitando la activación de la proteína Jun/activadora 1(AP-1)  por la acumulación excesiva de lípidos. Y por consecuencia de la deficiencia de H3K36m3 contribuye a la obesidad de diversas manera como alteraciones en el metabolismo, aumento del apetito y acumulación de grasa corporal. 

Imagen obtenida de: http://dx.doi.org/10.1002/mco2.496

    Referencias Bibliográficas:

1.  Long Y, Mao C, Liu S, Tao Y, Xiao D. Modificaciones epigenéticas en enfermedades asociadas a la obesidad. MedComm [Internet]. 2024 [citado el 8 de junio del 2024];5(2). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1002/mco2.496

Alteraciones en la traducción en la insuficiencia cardiaca

                   

La proteína 1 de unión a la caja Y (Ybx1) regula la traducción de ARNm dependiendo de sus concentración influye en la estabilidad, procesamiento y traducción de proteínas. El Ybx1 es considerado una proteína de unión a ARN (RBP) el cual es indispensable para controlar la expresión genética y la función cardiaca en la insuficiencia cardiaca  después de haber recibido una señal patológica  de mTORC1.  Además el agotamiento de Ybx1 se ve relacionado con la reducción en el crecimiento y proliferación celular de los cardiomiocitos.

Imagen obtenida de: https://www.lapalabrabierta.com/2022/04/03/insuficiencia-cardiaca-la-pandemia-silente/

Referencias Bibliográficas

1. Varma E, Burghaus J, Schwarzl T, Sekaran T, Gupta P, Górska AA, et al. El control traslacional de la expresión de Ybx1 regula la función cardíaca en respuesta a la sobrecarga de presión in vivo. Básico Res Cardiol [Internet]. 2023 [citado el 1 de junio de 2024];118(1). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1007/s00395-023-00996-1

Alteración de la transcripción en la enfermedad renal crónica

La alteración de la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keap1) regula negativamente el factor nuclear 2 regulado por el eritroide 2 (Nrf2), el cual altera la transcripción de la regulación del sistema de defensa antioxidante. Además la alteración en el factor inducible por hipoxia (HIF) afecta a la adecuada respuesta transcripcional al estrés hipóxico puesto que participa  en los procesos de  angiogénesis, eritropoyesis, glucólisis, diferenciación celular y  apoptosis. Tanto la alteración del Nrf2 y HIF se ven vinculados con la enfermedad renal crónica.

Imagen obtenida de: https://www.mdpi.com/1420-3049/23/5/1123

Referencias Bibliográficas 

1. Hishikawa A, Hayashi K, Itoh H. Transcription factors as therapeutic targets in chronic kidney disease. Molecules [Internet]. 2018 [citado el 25 de mayo de 2024];23(5):1123. Disponible en: https://www.mdpi.com/1420-3049/23/5/1123