Terapia epigenómica del cáncer

Tema: Epigenética del cáncer- de los estudios de laboratorio y los ensayos clínicos a la medicina de precisión

Mecanismo epigenómico tratado: Metilación del ADN

Cómo se lo hizo: 

• Desmetilación Pasiva: Ocurre durante la replicación del ADN cuando la metilación no se mantiene en la hebra recién sintetizada. Esto sucede por la actividad empleada de ADN metiltransferasa 1 (DNMT1)
• Desmetilación Activa: Por medio de un proceso enzimático en el cual los grupos metilo son removidos de la citosina. Proceso regulado por una serie de enzimas principalmente de la familia TET (Ten-Eleven-Translocation). Estas enzimas catalizan la conversión  5-metilcitosina (5mC) a 5-hidroximetilcitosina (5hmC), y luego a otros intermediarios (como 5-formilcitosina y 5-carboxicitosina), que finalmente son reemplazados por citosina no modificada a través de un mecanismo de reparación por escisión de base (BER).

Inhibidores utilizados: ADN metiltransferasas (DNMTi) como la azacitidina (AZA) y la decitabina (DAC). Estos fármacos se incorporan al ADN durante la replicación y se unen a las DNMTs.

Resultados: Los fármacos AZA y DAC han demostrado ser efectivos en la reactivación de genes supresores de tumores y abriendo una mejoría a la posibilidad de supervivencia en pacientes con ciertos tipos de cáncer. Cabe resaltar que la eficacia puede ser variable y limitada en cada uno de los pacientes ya sea por tumores sólidos, heterogeneidad del cáncer y los mecanismos de resistencia.

Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41420-024-01803-z

Referencias Bibliográficas:

1. Yu X, Zhao H, Wang R, Chen Y, Ouyang X, Li W, et al. Epigenética del cáncer: de los estudios de laboratorio y ensayos clínicos a la medicina de precisión. Descubrimiento de muerte celular [Internet]. 2024 [citado el 1 de septiembre de 2024];10(1):1–12. Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41420-024-01803-z

Técnicas de edición de ácidos nucleicos en enfermedades cardiovasculares

Título: CRISPR-Cas9 como terapia de protección de enfermedades cardíacas

Tipo de Edición: Somática [células madre hematopoyética (HSC)], ex vivo

Dirigido hacia: gen PCSK9- locus 1p32.3/ gen ANGPT3 en ratones (knock-out)

Dirigido por: CRISPR/ CAS9

Órgano a tratar: Principalmente corazón, hígado e intestino delgado

Vía de administración: Hígados humanizados de ratones- in vivo. Se inactivo el gen PCSK9 que está relacionado con el metabolismo y el riesgo de enfermedades cardíacas. La administración se hizo mediante inyección en el hígado, donde el sistema CRISP-Cas9  inactive permanentemente al gen  (PCSK9). Luego se vigila como la cantidad de proteína PCSK9 en sangre disminuye y los niveles de colesterol LDL.

Resultados     

Al existir mutaciones en el gen ANGPTL3 puede producir un efecto en 4 áreas como son: reducción en niveles de colesterol, disminución de triglicéridos, menor probabilidad de enfermedad cardíaca y menor riesgo de diabetes.

• Resultados a corto plazo: Se logro reducir los niveles de colesterol  LDL en un 35- 40%. Se observado que se mantienen bajos durante varios meses, indicando que su inactivación es  efectiva.

• Resultados a mediano plazo: Se plantea investigaciones para evaluar efectos secundarios o complicaciones derivadas por la edición génica y a su vez la respuesta por el organismo ante la disminución del PCSK9.

• Resultados a largo plazo: Se plantea que la intervención generaría una reducción hasta un 90% en el riesgo de enfermedades de arterias coronarias.

Imagen obtenida de: https://www.nationalgeographic.com.es/ciencia/la-edicion-genetica-logra-proteger-a-los-ratones-de-enfermedades-cardiacas_19365

Referencias Bibliográficas:

1. Vetcher D. CRISPR-Cas9 como terapia de protección de enfermedades cardíacas. Revista Argentina de Cardioangiología Intervencionista [Internet]. 2022;13(2):61-67. Disponible en:  28900610067.pdf (meducatium.com.ar)                                                   

Terapia Celular o Terapia con Stem Cells

Título: Eficacia de las células estromales mesenquimales (MSC) como tratamiento para pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC)

Tipo de Stem Cells: Células estromales mesenquimatosas (MSC)

Método de obtención: Las MSC se obtuvieron del cordón umbilical y de la médula ósea.

• Se realizo una aspiración de médula ósea de la cresta ilíaca y se extrajo células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimatosas
• Se recolecto el cordón umbilical después del parto y se extrajo células estromales mesenquimatosas. Por aislamiento de la sangre del cordón y del tejido del cordón (como el gel de Wharton).

Vía de administración: Vía  intravenosa (IV) por los mícrovasos pulmonares.

Resultados a corto plazo: Reconocen el microambiente pulmonar y actúan de forma rápida, reduciendo la  inflamación y alivia los síntomas de la Enfermedad Obstructiva Pulmonar Crónica. Además de disminuir la apoptosis favoreciendo la recuperación del tejido pulmonar y por tanto mejorando la función respiratoria en un corto período de tiempo.

Resultados a mediano plazo: Reducción de la inflamación pulmonar y la fibrosis. Mejora la regeneración de las capas del epitelio pulmonar y como resultado reducción significativa de los síntomas. Generando una mejor calidad de vida y capacidad funcional para la realización de las actividades diarias 

Resultados a largo plazo: La mayoría de células estromales mesenquimales se eliminan en la primera semana y a pesar de esto los beneficios continúan a lo largo del tiempo. Es por esto que se mantiene los efectos positivos como la reducción de la inflamación, mejorar la función pulmonar y calidad de vida de las personas.

Imagen obtenida de: https://www.saudeter.com/que-es-la-enfermedad-pulmonar-obstructiva-cronicaepoc-y-consejos-nutricionales/

Referencia Bibliográfica

1. Abad Molina EP, Ortiz Reinoso SA, Coyago Iñiguez JA, León Martínez FM. Eficacia de las células estromales mesenquimales (MSC) como tratamiento para pacientes con enfermedad obstructiva crónica (EPOC): Revisión Sistemática. RECIMUNDO[Internet]. 2023 [citado el 16 de agosto del 2024];7(1):654–63. Disponible en: https://recimundo.com/index.php/es/article/view/2002

Animal transgénico para uso de la medicina

ACTIVIDAD 1 

Tema: Diseño y prueba de un donante porcino humanizado para xenotrasplantes

1) Tipo de animal transgénico y genes involucrados

•  Raza de cerdo miniatura de Yucatán (Donante porcino humanizado)
• Genes involucrados:  

GGTA1: este gen codifica una glicosiltransferasa que produce el epítopo galactosilα1,3-galactosa (Gal)

CMAH: Este gen está relacionado con la síntesis de ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc)

B4GALNT2/B4GALNT2L:  involucrados en la síntesis de ciertos glicanos.

Además se introdujo transgenes humanos como: CD46, CD55, THBD, PROCR, CD47, TNFAIP3 y HMOX1

Todos estos genes son muy importantes para la aceptación del injerto y reducir el rechazo por parte de los anticuerpos.

2) Métodos de obtención

• Diseño de ARN guía: Para dirigir el sistema CRISPR/Cas9 a los genes objetivo para la eliminación o inserción.

• Edición Genética: Se utiliza CRISPR/Cas9 para realizar las modificaciones deseadas en el genoma del cerdo. Permitiendo la eliminación de genes (knock-out) y la inserción de transgenes humanos (knock-in).

• Transferencia Nuclear de Células Somáticas (SCNT): Se realiza la transferencia del núcleo de una célula somática modificada a un óvulo enucleado (se le ha removido el núcleo) para formar un embrión.

• Implantación y Desarrollo: El embrión se implanta en una cerda de alquiler, donde se desarrolla hasta el nacimiento.

• Selección y Análisis: Los cerdos nacidos se analizan genéticamente para confirmar que llevan las modificaciones deseadas. Se realizan pruebas adicionales para verificar la expresión de los transgenes y la funcionalidad de las modificaciones.

3) Utilización de los animales transgénicos 

• Raza de cerdo miniatura de Yucatán: Utilizado para realizar  un trasplante de riñón porcino modificado genéticamente a un mono cynomolgus. Con estos estudios poder a futuro ponerlos a prueba en humano y  pueda ser genéticamente compatible, tenga un riesgo mínimo de rechazo y proporcione una buen funcionalidad. (1)

Imagen obtenida de : https://www.nature.com/articles/s41586-023-06594-4

ACTIVIDAD 2

5 ventajas y 5 desventajas de los transgénicos

VENTAJAS

• Por medio microorganismos transgénicos (bacterias)  permiten utilizarlos para producir  medicamentos a gran escala y de manera mas eficiente y rápida.

• Mediante los animales transgénicos permiten ampliar en el campo de la investigación para estudiar enfermedades humanas y desarrollar tratamientos (2)

• Por medio de la ingeniería genética se ha ocupado en los animales transgénicos para producir proteínas terapéuticas permitiendo el desarrollo innovador ante enfermedades. (3)

• Han generado un gran avance en el desarrollo de terapias génicas para corregir  defectos genéticos a nivel celular, permitiendo corregir mutaciones de enfermedades raras.  (4)

• Las plantas modificadas genéticamente permiten producir antígenos virales para facilitar la producción de vacunas de forma rápida. (5)

DESVENTAJAS

• Los medicamentos que se realizaron por medio de organismo transgénicos pueden generar efectos adversos debido a que contengan contaminantes o proteínas no deseadas (2)

• El uso de animales para las investigaciones de enfermedades se ve muy relacionado con el bienestar animal. Ya que ellos también son seres vivos , sienten y pueden estar expuestos al sufrimiento. (5)

• Puede existir contaminación genética debido que existe la posibilidad de que los genes modificados se transfieran a otras especies o al medio ambiente, provocando consecuencias que no se puedan predecir.

• El uso de transgénicos para el desarrollo de terapias puede ser muy costoso y ser un proceso complejo y a la vez largo. Es por esto que limita la accesibilidad para personas que no posean una gran entrada económica a su hogares. 

• Puede haber problemas de acceso y equidad  en el suministro de medicamentos o vacunas  debido a las patentes de estos productos. (4)

Referencias Bibliográficas:

1. Anand R, Layer J, Heja D, Hirose T, Lassiter G, Firl D. Diseño y prueba de un donante porcino humanizado para xenotrasplante. Nature [Internet]. 2023 [citado el 27 de julio de 2024];622(7982):393–401. Disponible en: https://www.nature.com/articles/s41586-023-06594-4
2. Simmons D. El uso de modelos animales en el estudio de enfermedades genéticas. Scitable by Nature Education [Internet]. 2008 [citado el 27 de julio de 2024]. Disponible en: https://www.nature.com/scitable/topicpage/the-use-of-animal-models-in-studying-855/

3. Seok Y. Avances recientes en la terapia con anticuerpos. Int J Mol Sci [Internet]. 2022 [citado el 27 de julio de 2024];23(7):3690. Disponible en: http://dx.doi.org/10.3390/ijms23073690

4. Sharaf  W. Tecnologías de edición genética y ensayos clínicos relacionados para el tratamiento de enfermedades genéticas y adquiridas: una revisión sistemática. Egypt J Med Hum Genet [Internet]. 2024[citado el 27 de julio de 2024];25(1). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1186/s43042-024-00501-w

5. Salazar-González JA, Rosales-Mendoza S. Una perspectiva para la vacunación contra la aterosclerosis: ¿hay lugar para las vacunas de origen vegetal? Vaccine [Internet]. 2013;31(10):1364–9. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2013.01.005

6. Perry P. La ética de la investigación con animales: una perspectiva del Reino Unido. ILAR J [Internet]. 2007 [citado el 17 de julio de 2024];48(1):42–6. Disponible en: https://academic.oup.com/ilarjournal/article/48/1/42/690435?login=false

ADN recombinante artificial y natural

ACTIVIDAD 20 

ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

Tema: Producción de proteínas candidatas como dianas terapéuticas contra la malaria

Objetivos:  

• Extracción del gen cyrpa de muestras sanguíneas de pacientes del sur de México.
• Secuenciación del gen cyrpa y análisis de polimorfismos.
• Clonación del gen cyrpa en un plásmido para su utilización en la transformación de células procariotas.
• Expresión de la proteína CyRPA en células procariotas.

Gen o secuencia a clonar: Gen cyrpa

Enzima de restricción: BamHI y Ndel

Enzima ligasa: Ligasa de ADN T4

Vector: pET-9a(+)

Célula receptora: Procariota - Escherichia coli cepa BL21 (DE3)

Mecanismo de transferencia: Transformación por Shock Térmico

Métodos de identificación de clones: 

• Por medio de cultivo líquido en medio Luria-Bertani (contabilizo número de colonias)
• PCR,  Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, Técnicas fluorométricas (SYBR Green). 
• Gen resultante cyrpa
• Proteína obtenida CyRPA
• Se plantea el uso de vectores virales recombinantes como estrategias prometedoras en la lucha contra la malaria (1)

Imagen obtenida de: https://repositorio.ual.es/handle/10835/10260

ADN RECOMBINANTE NATURAL

Transposones o genes saltarines  

Son secuencias de ADN que tienen la capacidad de poder cambiarse de posición en el genoma. Por tanto son capaces de generar diversas formas de expresión de genes o a su vez mutaciones.(2)

Imagen obtenida de: https://ciencia.estudiareneuropa.eu/s/3975/76710-Medicina-Sanidad/4085608-Los-transposones-y-el-desarrollo.htm

Referencias Bibliográficas

1. Cebrián J. Producción de proteínas candidatas a dianas terapéuticas frente a la malaria. Universidad de Almería [Internet]. 2020 [citado el 17 de julio de 2024]. Disponible en: https://repositorio.ual.es/handle/10835/10260

2. Kumar A. Saltar: transposones dentro y fuera del laboratorio. F1000Res [Internet]. 2020 [citado el 18 de julio de 2024];9(135):135. Disponible en: https://f1000research.com/articles/9-135/pdf

   
   

Hibridación fluorescente in situ en carcinoma uroterial

La hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizó para detectar alteraciones cromosómicas en células uroteliales. En especifico las aneuploidías en los cromosomas (cr) 3,7,17 y para la pérdida del locus 9p21.  Se utilizo sondas específicas marcadas con fluorocromos  (secuencias de ADN complementario) y se hibridaron con muestras de células uroteliales fijadas y mediante la emisión de señales fluorescentes se puedo observar y analizar las muestras por medio  del microscopio de fluorescencia. 

Disponible en: 

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0210480612003889?via%3Dihub

Referencias bibliográficas 

1. García-Peláez B, Trias I, Román R, Pubill C, Banús JM, Puig X. La hibridación in situ fluorescente en la predicción de recurrencia del carcinoma urotelial. Actas Urol Esp [Internet]. 2013 [citado el 22 de junio del 2024];37(7):395–400. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1016/j.acuro.2012.11.005. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0210480612003889?via%3Dihub

RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus

Tema: Ensayo de RT-PCR en tiempo real para genotipado de rotavirus

Objetivo: Evaluar la eficacia de la PCR en tiempo real como una herramienta de diagnóstico para la detección y genotipado de cepas de rotavirus en muestra de heces de pacientes con gastroenteritis aguda.

Muestra biológica: Heces  (niños de 5 años o menos con un diagnóstico primario de gastroenteritis aguda no sanguinolenta) 

Tipo de ácido nucleico: ARN de rotavirus

Extracción de ácido nucleico:  Las muestras de heces primero  fueron almacenadas a -70°C después del análisis primario y se preparó una suspensión  de peso por volumen (p/v). Se disolvió un gramo o 100 µl de cada muestra de heces en 1000  µl de Buffer Salino Fosfato (PBS), la muestra se centrifugó a 1500 xg durante 20 minutos. Se extrajo el ARN de rotavirus  de 10µl  del sobrenadante filtrado mediante el método  estándar con fenol-cloroformo.  Luego se realizo la transcripción inversa para poder sintetizar el ADN complementario utilizando el kit de transcripción  inversa RevertAid RT.

Gen o secuencia a amplificar:  Del gen VP7 se amplifico los genotipos  (G1, G2, G9)  y del gen  VP4 se  amplifico los genotipos (P4 y P8).

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Tipo de PCR:  PCR en tiempo real TaqMan y PCR multiplex semianidada

Pasos: 

      1.    Pre-ciclo: 95°C durante 5 minutos

      2.    40 ciclos de amplificación: 

             a) Desnaturalización: 94°C durante 1 minuto

             b) Alineación: 55°C durante 1 minuto

             c)Extensión: 72 °C durante 1 minuto

     3.     Elongación final: 72°C durante 10 minutos

Visualización: Fueron analizados en gel de agarosa al 2% y visualizados utilizando GelRed (tinte ocupado para tinción de ácidos nucleicos) permite determinar  presencia, tamaño y cantidad de los fragmentos amplificados. Los fragmentos de ADN amplificados se separan  por tamaño en el gel de agarosa mediante electroforesis.

Imagen obtenida de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/

Referencias Bibliográficas: 

1. Mousavi-Nasab SD, Sabahi F, Kaghazian H, Paryan M, Mirab Samiee S, Ghaderi M, et al.   Un ensayo de RT-PCR en tiempo real para el genotipado de rotavirus. Irán Biomed J [Internet]. 2020 [citado el 14 de junio de 2024];24(6):394–9. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7601544/